3. NAC2激活SAMT1轉(zhuǎn)錄

接下來，研究人員開始探索NAC2和MeSA生物合成之間的分子遺傳機(jī)制。NAC2作為轉(zhuǎn)錄因子（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b），可以定位于細(xì)胞核中（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c）。隨后，研究人員對(duì)有和沒有蚜蟲喂食的WT和NAC2植株進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）和比較轉(zhuǎn)錄組分析，并鑒定了許多潛在的NAC2調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充表1和2），其中SAMT1的結(jié)果特別令人感興趣（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4e）。無論這些植物是否受到蚜蟲的侵襲，NAC2植株的SAMT1 RNA水平都低于WT植株（補(bǔ)充表1和2）。SAMT1將SA轉(zhuǎn)化為MeSA19，研究人員通過定量研究NAC2、HA-NAC2過表達(dá)和WT植株葉片組織中的SAMT1轉(zhuǎn)錄本，以評(píng)估NAC2是否通過調(diào)節(jié)SAMT1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，與WT植株相比，NAC2植株的SAMT1 mRNA水平顯著降低，但HA-NAC2過表達(dá)植株的SAMT1 mRNA水平升高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d，e）。此外，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，NAC2增強(qiáng)了SAMT1啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3f）。ChIP–qPCR、酵母單雜交和EMSA分析均表明，NAC2與SAMT1啟動(dòng)子結(jié)合，并激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3g-i）。此外，NAC2的瞬時(shí)過表達(dá)增加了植物MeSA的產(chǎn)生（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 3j）。這些結(jié)果表明，NAC2-SAMT1模塊與植物MeSA生物合成的調(diào)控有關(guān)。

4. SA激活NAC2-SAMT1模塊引發(fā)AD

為了研究NAC2是否通過激活SAMT1轉(zhuǎn)錄影響接收植株MeSA的產(chǎn)生，研究人員評(píng)估了不同處理?xiàng)l件下突變株NAC2、NahG和WT植株中的NAC2和SAMT1的mRNA水平（圖 2f）。蚜蟲侵襲后，WT和NAC2植株的SA水平升高程度相近，然而，細(xì)胞MeSA和SAMT表達(dá)的增加僅在WT植株中發(fā)現(xiàn)（圖2e-g）。在WT接收植株和NAC2接收植株鄰近蚜蟲侵襲植株中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖 2h-j）。這些結(jié)果表明，NAC2是蚜蟲定向誘導(dǎo)或蚜蟲介導(dǎo)的SAMT1表達(dá)和揮發(fā)性MeSA產(chǎn)生所必需的。此外，外源性SA上調(diào)了NAC2和SAMT1在WT植株中的表達(dá)，但在NAC2突變株中SAMT1 mRNA的表達(dá)水平未顯著改變（圖 2k，l）。與NAC2突變株相比，外源性SA也誘導(dǎo)WT植株的MeSA揮發(fā)性和蚜蟲驅(qū)避性（圖2m–p），并增加SAMT1-KO植株中NAC2和SAMT1轉(zhuǎn)錄本的水平（圖 2q；圖2b，c），samt1植株對(duì)蚜蟲的吸引力也更強(qiáng)，而且在samt1植株中外源性SA不誘導(dǎo)蚜蟲驅(qū)避（圖2r-t）。此外，暴露于蚜蟲侵襲的samt1植株中揮發(fā)性MeSA的產(chǎn)生減少（圖3a，b），在進(jìn)一步的蚜蟲行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)與鄰近模擬的WT接收植株相比，鄰近蚜蟲侵襲的WT發(fā)射植株的WT接收植株對(duì)蚜蟲的驅(qū)避性更強(qiáng)，然而，無論何時(shí)將這些發(fā)射植株暴露于蚜蟲侵襲中，與NAC2或SAMT1發(fā)射植株相鄰的WT接收植株在蚜蟲驅(qū)避性方面都沒有顯著差異（圖3c-e）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了MeSA作為植物AD中PPC信號(hào)的作用。總的來說，結(jié)果表明SA可以激活NAC2-SAMT1轉(zhuǎn)錄進(jìn)而增加發(fā)射和接收植株中揮發(fā)性MeSA的產(chǎn)生。

作為一種SA結(jié)合蛋白，SABP2也可以與MeSA結(jié)合，這對(duì)于細(xì)胞內(nèi)MeSA轉(zhuǎn)化為SA至關(guān)重要。因此，SABP2可以作為一種OBP樣受體，感知并將發(fā)射植株產(chǎn)生的揮發(fā)狀態(tài)MeSA轉(zhuǎn)化為SA以觸發(fā)NAC2介導(dǎo)的接收植株中的蚜蟲抗性。為了驗(yàn)證這一想法，研究人員首先確認(rèn)SABP2與SA結(jié)合（圖3f），通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MeSA是否影響SABP2-SA的結(jié)合活性（圖3g）。在無MeSA的情況下，SABP2-[3H]SA（50 Ci mmol?1）結(jié)合力為100%。然而，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，3nM和15nM的MeSA，SABP2對(duì)[3H]SA的結(jié)合活性分別降低到約74%和46%（圖3g）。因此，3nM的MeSA足以滿足用于[3H]SA與SABP2的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，表明MeSA可以以生理濃度與SABP2結(jié)合。隨后，研究人員建立了SABP2-KO突變株（sabp2），并測(cè)試了sabp2突變株與WT植株的蚜蟲驅(qū)避性，用揮發(fā)性的MeSA處理，然后進(jìn)行通氣，揮發(fā)性的MeSA處理可增加WT的蚜蟲驅(qū)避性和SA生物合成，但對(duì)于sabp2突變株并沒有增加（圖3h-j和擴(kuò)展圖2d）。此外，蚜蟲喂食WT發(fā)射植株增加了WT植株的蚜蟲驅(qū)避性，但sabp2未增加（圖3k）。此外，外源性的SA對(duì)WT和sabp2植株的MeSA揮發(fā)性無顯著差異，表明SABP2對(duì)MeSA的釋放不是必須的（圖3l，m）。這些結(jié)果表明，SABP2確實(shí)是一種OBP樣受體，可以感知并將空氣中的MeSA轉(zhuǎn)化為SA，引起NAC2介導(dǎo)的蚜蟲驅(qū)避性。

SAMT1是植物抗病毒免疫所必需的。為了測(cè)試SAMT1是否為NAC2介導(dǎo)的植物抗病毒免疫中的一個(gè)組成部分。研究人員敲低（KD）samt1植株中的NAC2，使用基于煙草脆裂病毒（TRV）誘導(dǎo)的基因沉默產(chǎn)生nac2/samt1雙突變植株。與NAC2突變株一樣，NAC2-KD植株表現(xiàn)出正常生長(zhǎng)，和對(duì)CMV和PVY的高易感性（圖1e-j，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a-e，h-l），表明病毒誘導(dǎo)的基因沉默NAC2-KD與NAC2-KO株有相似性。然而，nac2/samt1和samt1植株表現(xiàn)出相似程度的CMV或PVY易感性（圖 5a-e，h-l）。此外，CMV感染增強(qiáng)了植物細(xì)胞內(nèi)MeSA水平（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5f）。在病毒感染期間，NAC2-KD、samt1和nac2/samt1植株的未侵襲葉片產(chǎn)生相似數(shù)量的MeSA，但與WT植株相比，數(shù)量較低（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5g）。此外，作者還研究了外源性MeSA或SA在nac2、sabp2、samt1和WT不同植株中，MeSA是否以及如何通過NAC2介導(dǎo)植物抗病毒防御。與WT植株相比，nac2、samt1和sabp2植株對(duì)CMV和PVY更易感（圖3n，o）。然而，外源性MeSA可以降低nac2和samt1植株的病毒易感性，但對(duì)sabp2植株無效（圖 3n，o），可能是由于WT、nac2和samt1植株中的MeSA轉(zhuǎn)化為 SA。外噴SA也可以降低nac2、samt1和sabp2植株的病毒易感性（圖3n，o）。這與以下事實(shí)一致：SA可以抑制多種病毒對(duì)植物的感染，包括CMV、馬鈴薯病毒X和TMV。

綜上所述，MeSA結(jié)合蛋白SABP2能夠在結(jié)合MeSA時(shí)，將細(xì)胞間的MeSA轉(zhuǎn)化成SA。由此實(shí)現(xiàn)信號(hào)的發(fā)起。隨后SA激活NAC2-SAMT1模塊，以此上調(diào)內(nèi)源MeSA水平，促進(jìn)NAC2依賴性SAMT1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。